El flujo de trabajo de secuenciación de Illumina consta
de cuatro pasos básicos: preparación de muestras, generación de grupos, secuenciación y análisis de datos. Hay varias maneras diferentes de preparar las muestras. Todos los métodos de preparación agregan adaptadores a los extremos de los fragmentos de ADN. A través de la amplificación de ciclo reducido, se introducen motivos adicionales , como el sitio de unión de secuenciación , índices y regiones complementarias a los oligos de células de flujo. La agrupación es un proceso en el que cada molécula de fragmento se amplifica isotérmicamente. La celda de flujo es un portaobjetos de vidrio con carriles. Cada carril es un canal revestido de un césped, compuesto por dos tipos de oligos. La hibridación está habilitada por el primero de los dos tipos de oligos en la superficie. Este oligo es complementario a la región adaptadora en una de las hebras del fragmento. Una polimerasa crea un complemento del fragmento hibridado. La molécula de doble cadena se desnaturaliza y la plantilla original se elimina por lavado. Las hebras se amplifican clonalmente a través de la amplificación de puente.
En este proceso, la hebra se pliega y la región adaptadora se hibrida con
el segundo tipo de oligo en la celda de flujo. Las polimerasas generan la hebra complementaria formando un puente de doble hebra. Este puente se desnaturaliza, lo que da como resultado 2 copias monocatenarias de la molécula que se unen a la celda de flujo. Luego, el proceso se repite una y otra vez y ocurre simultáneamente para millones de grupos, lo que da como resultado la amplificación clonal
de todos los fragmentos. Después de la amplificación del puente, las cadenas inversas se escinden y se lavan, dejando solo las cadenas delanteras. Los tres extremos primarios están bloqueados para evitar un cebado no deseado . La secuenciación comienza con la extensión del primer cebador de secuenciación para producir la primera lectura.
Con cada ciclo, los nucleótidos marcados con fluorescencia compiten por agregarse a la cadena en crecimiento. Solo se incorpora uno en base a la secuencia de la plantilla. Después de la adición de cada nucleótido, los grupos se excitan con una fuente de luz y
se emite una señal fluorescente característica. Este proceso patentado se denomina secuenciación por síntesis. El número de ciclos determina la duración de la lectura. La longitud de onda de emisión, junto con la intensidad de la señal, determina la llamada base. Para un grupo dado, todas las hebras idénticas
se leen simultáneamente. Cientos de millones de grupos se secuencian en un proceso paralelo masivo. Esta imagen representa una pequeña fracción de
la celda de flujo.
Después de completar la primera lectura, el producto leído se elimina por lavado. En este paso, el cebador de lectura de índice 1 se introduce y se hibrida con la plantilla. Se genera la lectura, similar a la primera lectura. Después de completar la lectura del índice, el producto leído se lava y los tres extremos primarios de la plantilla se desprotegen. La plantilla ahora se pliega y une el segundo oligo en la celda de flujo. El índice 2 se lee de la misma manera que el índice 1. Las polimerasas extienden el segundo oligo de celda de flujo formando un puente de doble cadena. Luego, este ADN de doble cadena se linealiza y los tres extremos primarios se bloquean. La hebra delantera original se corta y se lava, dejando solo la hebra inversa. La Lectura 2 comienza con la introducción del manual de secuenciación de la Lectura 2. Al igual que con la lectura 1, los pasos de secuenciación se repiten hasta que se logra la longitud de lectura deseada.
A continuación, el producto de lectura 2 se elimina por lavado..